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PCR仪原理
时间: 2012-5-5 11:33:15    
它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR基本原理
    基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
    1、模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
    2、模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
    3、引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
    在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。50年代Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体(microsome)是细胞内蛋白质合成的部位;1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设;1961年Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合;1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构;特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码,随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性,从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。
    从分子生物学的发展过程,可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域,推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中,新成果、新技术不断涌现,但分子生物学的历史还短,积累的资料还不够。例如:在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息,迄今人类所了解的只是极少的一部分,还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律;又如即使到2005年我们已经获得人类基因组DNA3×109bp的全序列,确定了人的5-10万个基因的一级结构,但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调,要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等,都还要经历漫长的研究道路。可以说分子生物学的发展前景光辉灿烂,道路还会艰难曲折。
    平或放大真核细胞单拷贝基因,通过PCR方法都是不难完成的。
    4、特异性强 作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。
    5、对原始材料质量要求低含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者总RNA,就可以用做反应起始材料来获取目的产物。
    主要适用于生命科学、医学、农业科学、环境科学、考古学及历史事件解读和卫生安全方面。
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